线粒体是细胞的能源起头，影响细胞稳态、增殖、亏空的要津信号通路。由于线粒体的动态举止以及与其他细胞器的丰富互相作用，荧皎皎微镜的发展特地鞭策了线粒体计议。线粒体内膜（inner membrane，IM）向内凹下酿成好多层状或管状的内嵴，其间距时常小于100nm，导致传统荧皎皎微镜无法不雅察到其里面抽象结构。因此，基于固定样本的电子显微镜技巧一直动作捕捉线粒体膜结构的主流器具。比年来，活细胞线粒体纳米成像已从旨趣考据发展成为一种结构和功能计议的可行递次。其中，受激励射损耗纳米显微镜（STED）和结构光照赫然微镜（SIM）已被报说念用于活细胞的线粒体内嵴成像。可是，现在线粒体纳米结构的可视化大多局限于癌细胞的二维（2D）单色成像哥也色蝴蝶谷，正交战略尚未修复，且STED图像采聚合受到细胞器的光毁伤或快速光漂白的影响，很难不雅察到原生情景下的线粒体口头。

论文截图

2022年12月20日，北京大学改日技巧学院、北大-清华人命科学融合中心陈知行计议员课题组在Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.杂志上发表了题为“Multi-color live-cell STED nanoscopy of mitochondria with a gentle inner membrane stain” 的计议论文，并被选为封面著述。该计议报说念了一款适用于STED纳米显微镜的线粒体内嵴染料PK Mito Orange （PKMO），其具有优秀的光稳固性和权贵镌汰的光毒性，可结束在长生化哺乳动物细胞系、原代细胞和组织中的万古程、超分歧率的线粒体能源学成像，单个线粒体的3D-STED成像，以及多色STED成像（图1）。

哥也色蝴蝶谷

图1：PKMO标记的HeLa细胞线粒体内嵴、微丝卵白（SPY650FastAct）和细胞核（SPY505 DNA）的多色活细胞成像图

该计议哄骗环辛四烯（COT）偶联战略镌汰染料光毒性，同期精准调控光谱使得染料与561nm激励光和775nm STED光齐备兼容。PKMO染色后的细胞在STED纳米显微镜下，可不雅察到统统这个词细胞中具有高度有序的层状内嵴网罗，并以低至50nm的光学分歧率拿获了单个线粒体内嵴口头和线粒体分裂、和会以及管状发生等动态经过。PKMO因其仁爱的性质和优秀的光稳固性可结束活细胞中单个线粒体的3D STED重建。PKMO除了可应用于癌细胞和长生化的细胞系除外，也可结束对光毒性极为明锐的原代细胞和组织的超分歧成像。PKMO展示了在COS-7、HeLa、U-2 OS细胞系以及原代脂肪细胞、原代神经元、原代胰岛组织中的内嵴结构特地能源学经过。

线粒体的双层膜结构产生了线粒体亚区室，它们有着不同的用途。多色纳米显微镜技巧因其可提供较高的分歧率和更多的时空信息，将取代传统的生化分析或电子显微技巧成为一个强有劲的新式分析妙技。如图2所示，PKMO展示了与线粒体IM与线粒体DNA（mtDNA）、线粒体外膜、crista junction、微管卵白和内质网的多色超分歧成像。多色活细胞STED成像不错揭示生物分子的不同线粒体定位以及线粒体在全细胞内的互作网罗；可提供与条目更高的免疫电镜技巧雷同的信息，且可绘画关连续构和生物分子能源学的更多信息。

图2：线粒体内嵴与mtDNA、线粒体外膜、cristajunction、内质网、细胞骨架的多色STED成像

内嵴结构的弱势与细胞呼吸功能不容关连，并与神经退行性疾病或腹黑病关连。作家还展示了不同线粒体卵白弱势型的细胞系与野生细胞系的内嵴口头的各异。在改日，哄骗PKMO对活细胞进行超分歧成像有望取代传统耗时劳作的电镜制样，成为线粒体结构功能计议的平淡器具。

综上，作家团队报说念了一种兼容活细胞STED成像的、高亮度、低光毒性的新式线粒体探针。PKMO可在长生化的哺乳动物细胞系、原代细胞或组织中结束万古期、超分歧率的内膜能源学纪录。PKMO的光稳固性和光毒性为活细胞线粒体的3D STED显微镜成像掀开了大门。同期，PKMO可兼容绿色和远红荧光标记物，结束多色超分歧率下的线粒体亚结构的多组分分析。多色STED显微镜可在100nm分歧率下拿获线粒体与不同细胞因素的互相作用，BAX教授的细胞凋一火经过，以及转基因细胞中的内嵴表型。因此，这项责任提供了一个多功能的器具，用于以多路复用的表情计议线粒体内膜结构和能源学。

北京大学前沿交叉学科计议院、北大-清华人命科学融合中心2019级博士生刘天妍，马克斯·普朗克多学科科学计议所博士后Till Stephan （Stefan Jakobs课题组） 为共同第一作家。陈知举止本文的通信作家。陈知行课题组一直发奋于研发新式探针，助力改日成像技巧的发展，2018年建组以来重心在活细胞成像探针标的发力。之前的系列责任迷惑了马克斯·普朗克计议所Stefan Jakobs课题组共同谐和哥也色蝴蝶谷，深度展示了光学性能优异的PKMO探针在线粒体结构与功能计议中的应用后劲。现在该探针由南京浦海景珊生物技巧有限公司销售，并与瑞士Spirochrome公司谐和进行大师合手行。期待本后果能鞭策联系计议标的与超分歧成像组学新范式和会，成为领有自主学问产权的要津生物技巧，最终惠及雄伟线粒体计议责任者。

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